诊断狂犬病的方法 多种方法诊断狂犬病

诊断狂犬病的方法

于淼 助理兽医师

狂犬病又称恐水病，是人畜及野生动物共患的二类动物传染病，几乎所有的温血动物均易感。本病的储毒宿主复杂多样，给防控检疫带来诸多困难，以致本病仍在少数地区发生和流行，有些地区甚至还有回升趋势，常见一些病例见诸各大媒体报端。因其病死率为100%，危害极为严重，所以对其检疫和防控不容忽视。

1.病原介绍

病原体是狂犬病病毒（RV），犬和猫科动物、包括某些啮齿类动物以及蝙蝠等野生动物是病原的自然宿主，长期带毒。人和家畜感染的主要传染源是病犬或病猫。被患病动物咬伤是最常见的传播方式，损伤的皮肤黏膜被含有狂犬病病毒的唾液污染也可引起感染。多呈散发，连锁明显，即一个接一个地传染。染病动物狂暴不安，意识障碍，有主动攻击人畜行为，最后呈局部或全身麻痹而亡，病死率100％。

发病或带毒动物是本病的主要传染源，为此，及时确诊对本病的防控十分重要。

2.病原学诊断方法

2.1电镜观察。取被检动物的新鲜脑组织制成电镜负染标本或超薄切片，进行观察，发现本病毒即可确诊。由于所观察的样品有限，即使未检出RV，也不能否定本病。

2.2病毒分离鉴定。用2%健康犊牛血清制成盐水，将被检的脑、睡液等样品制成无菌乳剂，脑内接种5-7日龄的小鼠或1-1.2kg的健康幼兔，隔离饲养，盲传3代。如分离鉴定出RV则可确诊。

2.3荧光抗体染色。通常采用阻断对比法，生前用玻片压印眼球，制成角膜压印片，死后取海马回等脑组织，制备压印片2张，固定后，分别用经健康和死于狂犬病病毒感染鼠脑吸收的狂犬病毒荧光抗体染色，如仅在以健康鼠脑吸收的荧光抗体染色标本中检出特异性荧光细胞，则可诊断为本病。此法狂犬病犬脑的阳性检出率可达95%，实验感染小鼠角膜狂犬病病毒犬阳性检出率也达95%，与唾液腺的病毒出现相一致。

2.4酶标抗体染色法。应用以辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗RV特异抗体代替荧光抗体进行上述标本的免疫酶染色，在普通显微镜下，观察被检细胞浆内有无棕褐色颗粒或块，同样可以定论诊断。

2.5病毒核酸检查法。用事先制备的与RV某段基因互补的核酸引物或探针，通过对样品的RV核酸进行 RT－PCR扩增试验和原位杂交试验，检査实验感染的鼠脑其敏感性与特异性与 ELISA法相近。

2.6包涵体检查。此法最为简便，即用海马回等脑组织制成压印片，立即用Seller液染色、镜检，如在神经细胞的胞浆内检出嗜酸性的内基氏小体，也可以确诊。需要注意的是要与有可能出现的犬瘟热性包涵体以及脑中存在的非特异包涵体样物质相区別。但检不出包涵体不能排除狂犬病的可能。因狂犬病犬脑的包涵体检出率只有70%-90%。

3.血清学诊断方法

用事先制备好的RV抗原，应用此法检查被检血清有无相应的抗体存在，主要用于本病的免疫力监测，回顾性诊断与流行病学调査。

3.1中和试验。这是最常用也最重要的一种检测技术，至今许多新的检测技术仍以此为参照。中和抗体针对的是决定毒力的糖蛋白抗原，所以中和抗体的滴度，直接反应机体对RV的免疫能力，因而常被用作人畜狂犬病免疫力监测，狂犬疫苗评价和RV的血清型鉴定。

最常采用的术式是固定病毒稀释血清法，被检血清经稀释后，作一定倍数的连续稀释，各加等量200LD50的RV固定毒CVS株，37℃水浴作用1h后，分别脑内接种12-13g重的小白鼠，每个稀释度6只，然后根据各稀释度血清的小鼠死亡与存活数按Reed—Muench计算该待检血清的50%中和效价。

中和抗体出现较早，感染1周后即开始出现，3－4周后达最高峰，并可持续1－1.5年。因此通过双份血清的中和抗体检查，还有可能检出带毒的顿挫型感染病例。通过小鼠的交叉保护试验或细胞培养物的病变抑制试验，则可用于病毒的鉴定与型的分析。

3.2酶联免疫吸附试验（ELISA）。具有高度的敏感性和特异性，常被用于狂犬病抗体与细胞培养物及病料中RV抗原的检测。

检测抗体时多采用间接法，即先用提纯的RV预先包被聚苯乙烯微量滴定板，与不同稀释的被检血清感作、洗涤后，再加酶标的第二抗体，最后再加底物显色，结果呈现良好。李金中对包被法进行了改良，先用兔抗RVIgG包被，再加RV感染的小鼠脑悬液或细胞培养物，通过IgG将RV吸附到板上，免去RV浓缩提纯的步骤，效果同样满意。

检测RV抗原时，采用夹心间接法，即先用仓鼠抗RVIgG包被，随后加入被检脑组织或细胞培养物，冲洗后再依次加兔抗RV抗体和酶标驴抗兔IgG，最后加底物显色判定，结果也很满意。

4防制措施

平时加强对犬和猫的管理，对家犬进行定期免疫接种和彻底消灭鼠类是预防人和动物狂犬病的有效措施。发现病犬及其他患病动物应立即捕杀，尸体深埋或焚烧。被咬伤动物的伤口应及时处理，先用20％肥皂水冲洗，再用2％～3％碘酊消毒，同时注射狂犬病疫苗，可免于发病。

参考文献：

[1]李义.狂犬病的诊断与防治研究[J].上海畜牧兽医通讯,2018(04):56-57.

[2]王黎丽.狂犬病的危害及防控[J].畜牧兽医科技信息,2018(06):44.

[3]迟曼.狂犬病的病原分析和流行研究[J].兽医导刊,2016(24):105.

多种方法诊断狂犬病

于淼 助理兽医师

狂犬病又称恐水病，是人畜及野生动物共患的二类动物传染病，几乎所有的温血动物均易感。本病的储毒宿主复杂多样，给防控检疫带来诸多困难，以致本病仍在少数地区发生和流行，有些地区甚至还有回升趋势，常见一些病例见诸各大媒体报端。因其病死率为100%，危害极为严重，所以对其检疫和防控不容忽视。

1.病原介绍

病原体是狂犬病病毒（RV），犬和猫科动物、包括某些啮齿类动物以及蝙蝠等野生动物是病原的自然宿主，长期带毒。人和家畜感染的主要传染源是病犬或病猫。被患病动物咬伤是最常见的传播方式，损伤的皮肤黏膜被含有狂犬病病毒的唾液污染也可引起感染。多呈散发，连锁明显，即一个接一个地传染。染病动物狂暴不安，意识障碍，有主动攻击人畜行为，最后呈局部或全身麻痹而亡，病死率100％。

发病或带毒动物是本病的主要传染源，为此，及时确诊对本病的防控十分重要。

2.病原学诊断方法

2.1电镜观察。取被检动物的新鲜脑组织制成电镜负染标本或超薄切片，进行观察，发现本病毒即可确诊。由于所观察的样品有限，即使未检出RV，也不能否定本病。

2.2病毒分离鉴定。用2%健康犊牛血清制成盐水，将被检的脑、睡液等样品制成无菌乳剂，脑内接种5-7日龄的小鼠或1-1.2kg的健康幼兔，隔离饲养，盲传3代。如分离鉴定出RV则可确诊。

2.3荧光抗体染色。通常采用阻断对比法，生前用玻片压印眼球，制成角膜压印片，死后取海马回等脑组织，制备压印片2张，固定后，分别用经健康和死于狂犬病病毒感染鼠脑吸收的狂犬病毒荧光抗体染色，如仅在以健康鼠脑吸收的荧光抗体染色标本中检出特异性荧光细胞，则可诊断为本病。此法狂犬病犬脑的阳性检出率可达95%，实验感染小鼠角膜狂犬病病毒犬阳性检出率也达95%，与唾液腺的病毒出现相一致。

2.4酶标抗体染色法。应用以辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗RV特异抗体代替荧光抗体进行上述标本的免疫酶染色，在普通显微镜下，观察被检细胞浆内有无棕褐色颗粒或块，同样可以定论诊断。

2.5病毒核酸检查法。用事先制备的与RV某段基因互补的核酸引物或探针，通过对样品的RV核酸进行 RT－PCR扩增试验和原位杂交试验，检査实验感染的鼠脑其敏感性与特异性与 ELISA法相近。

2.6包涵体检查。此法最为简便，即用海马回等脑组织制成压印片，立即用Seller液染色、镜检，如在神经细胞的胞浆内检出嗜酸性的内基氏小体，也可以确诊。需要注意的是要与有可能出现的犬瘟热性包涵体以及脑中存在的非特异包涵体样物质相区別。但检不出包涵体不能排除狂犬病的可能。因狂犬病犬脑的包涵体检出率只有70%-90%。

3.血清学诊断方法

用事先制备好的RV抗原，应用此法检查被检血清有无相应的抗体存在，主要用于本病的免疫力监测，回顾性诊断与流行病学调査。

3.1中和试验。这是最常用也最重要的一种检测技术，至今许多新的检测技术仍以此为参照。中和抗体针对的是决定毒力的糖蛋白抗原，所以中和抗体的滴度，直接反应机体对RV的免疫能力，因而常被用作人畜狂犬病免疫力监测，狂犬疫苗评价和RV的血清型鉴定。

最常采用的术式是固定病毒稀释血清法，被检血清经稀释后，作一定倍数的连续稀释，各加等量200LD50的RV固定毒CVS株，37℃水浴作用1h后，分别脑内接种12-13g重的小白鼠，每个稀释度6只，然后根据各稀释度血清的小鼠死亡与存活数按Reed—Muench计算该待检血清的50%中和效价。

中和抗体出现较早，感染1周后即开始出现，3－4周后达最高峰，并可持续1－1.5年。因此通过双份血清的中和抗体检查，还有可能检出带毒的顿挫型感染病例。通过小鼠的交叉保护试验或细胞培养物的病变抑制试验，则可用于病毒的鉴定与型的分析。

3.2酶联免疫吸附试验（ELISA）。具有高度的敏感性和特异性，常被用于狂犬病抗体与细胞培养物及病料中RV抗原的检测。

检测抗体时多采用间接法，即先用提纯的RV预先包被聚苯乙烯微量滴定板，与不同稀释的被检血清感作、洗涤后，再加酶标的第二抗体，最后再加底物显色，结果呈现良好。李金中对包被法进行了改良，先用兔抗RVIgG包被，再加RV感染的小鼠脑悬液或细胞培养物，通过IgG将RV吸附到板上，免去RV浓缩提纯的步骤，效果同样满意。

检测RV抗原时，采用夹心间接法，即先用仓鼠抗RVIgG包被，随后加入被检脑组织或细胞培养物，冲洗后再依次加兔抗RV抗体和酶标驴抗兔IgG，最后加底物显色判定，结果也很满意。

4防制措施

平时加强对犬和猫的管理，对家犬进行定期免疫接种和彻底消灭鼠类是预防人和动物狂犬病的有效措施。发现病犬及其他患病动物应立即捕杀，尸体深埋或焚烧。被咬伤动物的伤口应及时处理，先用20％肥皂水冲洗，再用2％～3％碘酊消毒，同时注射狂犬病疫苗，可免于发病。

参考文献：

[1]李义.狂犬病的诊断与防治研究[J].上海畜牧兽医通讯,2018(04):56-57.

[2]王黎丽.狂犬病的危害及防控[J].畜牧兽医科技信息,2018(06):44.

[3]迟曼.狂犬病的病原分析和流行研究[J].兽医导刊,2016(24):105.