养狗用独霸，🦠疾病不用怕#宠物疾病 犬冠状病毒Ⅱ毒株的分离鉴定及基因的遗传进化分析

养狗用独霸，🦠疾病不用怕#宠物疾病

养狗时，我们难免会遇到幼犬患细小、犬瘟热、犬窝咳腺病毒附流感、冠状病毒高端螺旋体狂犬病等疾病的情况，这些疾病会严重威胁狗狗的生命，主要表现为呕吐、拉稀、痢疾、肺炎、结膜炎等症状。

狗狗患病时通常表现为精神不振、体温升高、食欲下降、咳嗽、气喘、血便、消瘦、排便困难、四肢抽搐等。这些都是病毒引起的疾病，即使接种疫苗也难以治愈。

应该如何用药呢？用什么药比较好呢？今天我想和大家分享一款好物，那就是毒霸。它是小瓶装，经济实惠，每瓶250毫升。当狗狗出现以上疾病问题时，直接取本品一瓶盖兑水5-10斤，直接自由饮水，既能治疗也能预防，具有清热解毒、解暑的作用。在这个季节使用效果更佳。疫苗免疫前后使用，同时能增强疫苗免疫效果，药效好、吸收快、药效持久，堪称狗狗的救命药，能在阎王手中拯救狗狗的生命！毒霸是纯中药，无毒无害、无残留，还能调节狗狗的各项生理机能，提高狗狗的应激力和抵抗力。无论你养的是什么品种的狗狗，小狗、大狗还是怀孕母狗，都可以放心使用，关键是它不仅效果好，而且价格也很实惠！

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犬冠状病毒Ⅱ毒株的分离鉴定及基因的遗传进化分析

文|浮生

编辑|浮生

前言

1971 年 BinnLN 等[1] 首次在德国分离到犬冠状病毒，犬冠状病毒病是由 CCV 引起的一种以胃肠道炎症为主要症状的高度接触性传染病,在全世界均有分布。

1996 年我国成功分离到犬冠状病毒，最近几年在军､警犬也逐渐流行，是目前对 养犬业影响较大的疾病之一｡

临床上 CCV 主要危害犬的肠道,患病幼犬常出现轻度或重度 腹泻,严重呕吐,脱水,食欲萎靡甚至偶尔死亡 ,一年四季均可发生，但冬季较为多发，在自然 感染病例中,6~12 周龄幼犬最易感｡

病毒分离

犬冠状病毒包括两种基因型，分别为 CCV-Ⅰ和 CCV-Ⅱ，专家学者认为 CCV 与猫冠状病 毒和猪传染性胃肠炎病毒有着共同的祖先。

CCV 与Ⅱ型猫冠状病毒的遗传进化关系较为紧 密，一部分 CCV 的 S 和 M 蛋白的基因序列与Ⅰ型猫冠状病毒较为接近，故参照猫冠状病毒的分型，将其命名为Ⅰ型 CCV。

而其他 CCV 毒株均与Ⅱ型猫冠状病毒接近，故将其归为一 类，命名为Ⅱ型 CCV。CCV-Ⅱ又可再细分为两种亚型，分别为 CCV-Ⅱa 和 CCV-Ⅱb｡

目前 在我国主要流行的毒株为 CCV-Ⅱ型，犬冠状病毒主要有 4 种结构蛋白,分别为纤突蛋白（S） ､跨膜蛋白（M）､小膜蛋白（E）和核衣壳蛋白（N）。

位于冠状病毒最外层的为 S 蛋白，其在病毒感染细胞过程中发挥重要作用，具有特异性｡

宿主细胞表面的受体能够与 S 蛋白的 N 端结合，诱导病毒粒子与细胞膜相互靠近,两者发生融合｡

其在病毒感染细胞的过程 中发挥不可替代的作用，S 蛋白的 C 端主要在病毒粒子的装配和蛋白的胞内运输过程中发挥 作用,并且还可以决定病毒能否引起致病，是 CCV 致病作用的主要成分｡

S 蛋白自身的抗原表 位是主要保护性抗原，可诱导机体产生中和抗体，N 蛋白（核衣壳蛋白）是一种与基因组 RNA 结合形成的复合物，在病毒粒子装配过程中与病毒膜蛋白相互作用的结构蛋白，对提高病毒 转录和装配效率起着至关重要作用，N 蛋白是 CCV 第二大结构蛋白，其保守性很强。

故而研究 S 基因有助于揭示冠状病毒的抗原变化､病毒感染细胞机制和基因重组规律， 本研究通过对长春市某宠物医院中腹泻的幼犬粪便进行病毒分离。

并通过 PCR 扩增､ 免疫荧光法鉴定,确定该分离毒株为犬冠状病毒，为研究该毒株与其他 CCV 毒株的遗传进化 关系,对分离毒株的 S、ORF-3、N 基因进行测序,并将该毒株与其他毒株的亲缘关系进行比 较分析｡

样品接种于生长状态良好的 CRFK 细胞，然后放入培养箱中培养,并且 设置阴性细胞对照组；当细胞病变（CPE）达到 80%时，反复冻融 3 次后收取病毒。

接毒后 72 H 未出现 CPE 的细胞，经反复冻融后再次接种细胞，每一代次均接种细胞经 PCR 检测， 盲传 4 代后，CPE 和 PCR 均为阴性者视为病毒分离阴性。

病毒 TCID50 的测定

对分离出的第 5 代病毒经 10 倍梯度稀释，接种于在 96 孔培养板 上已长至单层的 MDBK 细胞。每个稀释度设置 8 个孔重复，每孔 100 μL，同时设不接种 病毒的正常细胞空白对照孔，于 CO2 培养箱中培养，每日观察 CPE 情况，按照 Reed-Muench 法测定病毒的 TCID50。

将分离出的病毒进行 10 倍倍比稀释，共 5 个稀释度，接种于铺有CRFK 细胞的 96 孔板中，每个稀释度 8 个重复，每孔接种病毒液 100 µL，于 37 ℃恒温培 养 72 h；72 h 后弃去上清液，PBS 温和洗涤 3 次，每孔加入固定液（甲醇:丙酮=1:3）100 µL， 4 ℃条件下固定 30 min。

弃去固定液，每孔加入 100 µL PBS 洗涤，洗涤 3 次后，加入 VMRD 的直标免疫荧光抗体，每孔 50 µL，37℃、CO2培养箱孵育 40 min，PBS 洗涤 3 次后，于荧 光显微镜下观察结果。同时设未接病毒细胞孔作为阴性对照。

根据 Pratelli 等[10]合成两对引物 CCVⅠ-F/CCoVⅠ-R 和 CCVⅡ-F/CCVⅡ-R,用于病毒的基因型鉴定｡

Trizol 法提取分离病毒的 RNA,并通过反转录获得 cDNA,RT-PCR 法鉴定基因型，反应体系如下: Mix 30 μL。

上下游引 物各 2.0 μL，模板 2 μL；ddH2O 补足 30 μL，扩增条件为:95℃ 3 min;95℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 30 s，40 个循环；72℃ 10 min，4℃ 20 min，同时设置阴性对照组｡

将获得的 RNA 参照 Genstar 反转录试剂盒操作步骤进行反转录，使用高保真酶对分离 毒株的 3 个目的片段进行扩增｡根据 NCBI 中查询到 CCV1-71 株的基因序列（JQ404409.1） 并参考文献[11]，合成引物序列｡

RT-PCR 的反应体系如下: Mix 30 μL；上下游引物 各 2.0 μL，模板 2.0 μL；ddH2O 加至 50 μL｡反应条件为：95℃ 5 min；94℃ 45s；45-55℃ 30 s；72℃ 1kb/min；共 40 个循环。

72℃延伸 10 min，扩增产物 4℃保存，并设置阴性对照，反 应结束后，将 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳｡使用胶回收试剂盒按说明书操作步骤对目的片 段进行胶回收和 DNA 纯化，将回收产物送至库美公司进行测序。

将测序获得的 S 基因片段拼接，将拼接完整的 S 基因序列与 GenBank 中下载的 22 株 CCV 毒株的完整 S 基因序列，分析其同源性，并绘制该毒株的系统发育进化树。将测序成功的 ORF-3 与 N 基因同样绘制系统发育进化树。

病毒分离培养 将病毒样品感染优良状态的 CRFK 细胞，37℃O2 培养箱中持续培养 48 h｡接种 CRFK 细胞后细胞发生融合､脱落等病变｡

将第 4 代 CCV-01 感染 CRFK 细胞后第 48 h 以 CCV 单克隆 荧光标记抗体进行免疫荧光，在荧光显微镜下直接进行观察｡结果显示, 阴性对照组未观察 到荧光，接种分离毒株的细胞中产生可见特异性荧光,细胞形态多为梭形，证明成功分离出 CCV｡

使用Trizol提取法提取出样本RNA,之后进行cDNA转录,将合成的cDNA 作为模板，对目的片段进行 PCR 扩增,得到大小约为 105 bp 的目的条带；测序结果与预期相符，由此可证明分离的病毒为 CCV-Ⅱ型｡

PCR 扩增结果 对扩增 S 基因，N、ORF 引物各一对进行 PCR 扩增,均扩增出 与预期大小相符的 DNA 片段。

将 CCV-CC01 株 S 基因序列与 GeneBank 中 22 个序列进行序列比对, 绘制系统发育进化树｡结果显示,CCV- CC01 株 S 基因与美国分离的CCV S378 株亲缘关系最近,处于同一分支｡

将 CCV-CC01 株 ORF-3 与 N 基因序列与 GeneBank 中登录的冠状病毒基因组序列，共计 12 个序列进行序列比对，绘制核苷酸系统发育进化树｡

实验数据分析

结果显示,CCVCC01 株 ORF3 基因与英国分离的 INSAVC 株同源性较高，处于同一分支，N 基因与 意大利分离的 CCV 06-2008 株、美国分离的 CCV 1-71 株亲缘关系最近,位于同一分支 ｡

CCV-CC01 S 基因与 S378 同源性最高，为 99.9%，与 SARS-CoV-2/human 同源性较远，为 44.8%。

HBCL/Raccoon dog、GI432003/Raccoon dog 与 DM95/2003/ferret dog 为貂冠状病毒，TGEV-HX/pig 与 TGEV/pig 为猪传染性胃肠炎病毒，SARS-CoV-2/human 为新型冠状病毒，其余毒株为犬冠状病毒，CCV､貂冠状病毒和 TGEV 属于 α 冠状病毒属,其与 SARS-CoV-2 的遗传进化关系较｡

CCV 与 SARS-CoV-2 的基因组同源性为 39.3%~47.8%;猪传染性胃肠炎病毒与 SARS-CoV-2 的基因组同源性为 47.6%~47.7%;貂冠状病毒与 SARS-CoV-2 的基因组同源性为 43.3%~47.5%｡

该毒株与 α 冠状 病毒属参考株相同区域氨基酸序列具有较高相似性，与 TGEV 同源性为 83.1%~83.2%，与 貂冠状病毒同源性为 82.9%~91.1% ｡

CCV 纤突较大, 在物理和化学因素的作用下极其容易脱落,这导致 CCV 较难分离处理。

CCV 在 4℃或高温条件下长期储存在粪便中的存活率显著降低 ，CCV 在培养基或 VTM 中的传染性可在 4℃保存数天，在-20℃或-70℃保持几年，但在 37℃或室温下多日会失去传 染性，应该用生长培养基处理待诊断的粪便样品 ｡

本试验采用 DMEM 培养基稀释病料,极 大地维持了病毒的感染力，张科萌在 2018、2019 两年间, 检测吉林市 526 份犬腹泻病样本, 发现 CCV 阳性率为 20.53%｡

贾燕等于 2015—2016 年对郑州的 209 份疑似病例进行调查，结果表明，家养犬的感染 CCoV 病的概率高达 42.31％。

CCV 基因组 RNA 5′端至 3′端共有 10 个开放阅读框（ORF），5′端为 ORF1a和 ORF1b，两者重叠，其余 8 个 ORF 占整个基因组序列的 1/3，从 5′端到 3′端依次为 S ､ORF3a､ORF3b､ORF3c､E､M､N､ORF7a､ORF7b 基因｡

S 蛋白主要负责诱导机体产生中和 抗体， 它是决定细胞嗜性和能否致病的一个重要因素，也是现阶段疫苗研发关注的重要目的蛋白｡

冠状病毒分为 α､β､γ､δ4 个属，α 属主要包括犬冠状病毒､猪传染性胃肠炎病毒､猫冠状 病毒､猪流行性腹泻病毒（PEDV）和感染人类的 HCoV-229E 和 HCoV-NL63 毒株 ｡

β 属 主要包括严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）､中东呼吸综合征（MERS）及 2019 年在全球暴发的新型冠状病毒（SARS-Cov-2）｡

SARS-CoV-2 自暴发以来对全国的经济，生活造成巨大影响，时丹怡等[21]通过序列同源性比对发现，CCV 与 SARS-CoV-2 的进化关系 较远，同源性仅为 43.6%~44.0%｡

有科研工作者从香港患者饲养的 1 只 17 岁雄性博美宠物犬 身上采集的样本，经检测后结果显示为阳性，这表示人类在感染 SARS-CoV-2 后能够将 病毒传染给犬。但是现在仍未有研究表明 SARS-CoV-2 阳性犬只可以将 SARS-CoV-2 传染给同群动物和人类｡

Wan Ting 等发现貉、果子狸等多种野生动物均可携带传播冠状病毒，其 中貉样本中携带的四株新型犬冠状病毒与 CCV 毒株 CCV-HuPn-2018 的基因同源性达 93.65%-94.27%， 这种冠状病毒的跨物种传播风险值得关注。

结语

本研究成功扩增了 CCV-CC01 S 基因、ORF-3 基因及 N 基因片段并从病毒 S 蛋白、N 蛋白角度进行了遗传进化分析，希望能够为 SARS-CoV-2 的跨物种传播提供思路与数据｡

N 基因保守性很强，基本未发生突变，本研究获得的 CCV 分离株 S 蛋白的信息,将有助于了解国内 CCV 流行毒株的分子特 性,并为后续 CCV 各蛋白功能研究､基因重组分析和疫苗研究奠定了基础｡

参考文献

[1] 夏咸柱,邹啸环,黄耕,等.犬冠状病毒在我国首次分离成功[J].长春:国内兽医学报,1996,16(1):58.

[2] 李劲秋.犬冠状病毒病腹泻的诊断与治疗[J].成都:畜禽业,2016,(11):77-78.

[3] 沈美艳,孙秋艳,李舫,等.上海株犬冠状病毒的分离鉴定及 S 基因的遗传进化分析[J].北京:国内动物检 疫,2017,34(03):97-101.

[4] 张淑琴,谭斌,程世鹏.牛病毒性腹泻病毒基因 2 型毒株的分离与鉴定[J].上海:国内动物传染病学 报,2016,24(03):83-86.

[5] 王倩颖,王廷龙,刘可欣,等.基因 2 型牛病毒性腹泻病毒河南株分离鉴定及全基因序列分析[J].上海:国内动 物传染病学报:1-13.

[6] 王楷宬,庄青叶,李阳,等.新型冠状病毒 2019-nCoV 与动物冠状病毒进化关系分析[J].北京:国内动物检 疫,2020,37(03):3-12.